Za utvrđivanje kvalitativnog sastava mnogih prehrambenih proizvoda koristi se ksantoproteinska reakcija za proteine. Prisutnost aromatskih aminokiselina u spoju će dati pozitivnu promjenu boje testnog uzorka.
Što je protein
Zove se i protein, koji je građevinski materijal za živi organizam. Proteini održavaju volumen mišića, obnavljaju ozlijeđene i mrtve strukture tkiva različitih organa, bilo da se radi o kosi, koži ili ligamentima. Uz njihovo sudjelovanje nastaju crvene krvne stanice, regulira se normalan rad mnogih hormona i stanica imunološkog sustava.
Ovo je složena molekula, koja je polipeptid s masom većom od 6103 d altona. Strukturu proteina čine ostaci aminokiselina u velikim količinama, povezani peptidnom vezom.
Proteinska struktura
Posebnost ovih tvari u usporedbi s peptidima male molekularne težine je njihova razvijena prostorna trodimenzionalna struktura, podržana utjecajima različitihstupanj privlačnosti. Proteini imaju strukturu na četiri razine. Svaki od njih ima svoje karakteristike.
Primarna organizacija njihovih molekula temelji se na sekvenci aminokiselina, čija se struktura prepoznaje po reakciji ksantoproteina na protein. Takva struktura je periodično ponavljajuća peptidna veza -HN-CH-CO-, a radikali bočnog lanca u aminokarboksilnim kiselinama su selektivni dio. Oni su ti koji određuju svojstva tvari kao cjeline u budućnosti.
Primarna struktura proteina smatra se dovoljno snažnom, to je zbog prisutnosti jakih kovalentnih interakcija u peptidnim vezama. Formiranje sljedećih razina događa se ovisno o znakovima ustanovljenim u početnoj fazi.
Formiranje sekundarne strukture moguće je zbog uvijanja aminokiselinskog slijeda u spiralu, u kojoj se između zavoja uspostavljaju vodikove veze.
Tercijarna razina organizacije molekule nastaje kada se jedan dio spirale nadgradi na druge fragmente s pojavom svih vrsta veza između njih, s vodikovim, disulfidnim, kovalentnim ili ionskim spojem. Rezultat su asocijacije u obliku globula.
Prostorni raspored tercijarnih struktura sa stvaranjem kemijskih veza između njih dovodi do stvaranja konačnog oblika molekule ili kvartarne razine.
Aminokiseline
Oni određuju kemijska svojstva proteina. Postoji oko 20 glavnih aminokiselina,uključeni u sastav polipeptida u različitim sekvencama. To također uključuje rijetke aminokarboksilne kiseline u obliku hidroksiprolina i hidroksilizina, koji su derivati bazičnih peptida.
Kao znak ksantoproteinske reakcije prepoznavanja proteina, prisutnost pojedinih aminokiselina daje promjenu u boji reagensa, što ukazuje na prisutnost specifičnih struktura u njihovom sastavu.
Kao što se pokazalo, sve su to karboksilne kiseline, u kojima je atom vodika zamijenjen amino grupom.
Primjer strukture molekule je strukturna formula glicina (HNH− HCH− COOH) kao najjednostavnije aminokiseline.
U ovom slučaju, jedan od vodikova CH2- ugljik može se zamijeniti dužim radikalom, uključujući benzenski prsten, amino, sulfo, karboksi skupine.
Što znači reakcija ksantoproteina
Različite metode se koriste za kvalitativnu analizu proteina. To uključuje reakcije:
- biuret s ljubičastom bojom;
- ninhidrin za stvaranje plavo-ljubičaste otopine;
- formaldehid s crvenim mrljama;
- Folija sa sivo-crnim taloženjem.
Provođenjem svake metode dokazuje se prisutnost proteina i prisutnost određene funkcionalne skupine u njihovoj molekuli.
Postoji reakcija ksantoproteina na protein. Naziva se i Mulderov test. Odnosi se na reakcije boje na proteinima, ukoje su aromatične i heterocikličke aminokiseline.
Obilježje takvog testa je proces nitriranja cikličkih aminokiselinskih ostataka dušičnom kiselinom, posebno dodavanje nitro grupe u benzenski prsten.
Rezultat ovog procesa je stvaranje nitro spoja koji se taloži. Ovo je glavni znak ksantoproteinske reakcije.
Koje se aminokiseline određuju
Ne mogu se otkriti sve aminokarboksilne kiseline ovim testom. Glavna značajka ksantoproteinske reakcije prepoznavanja proteina je prisutnost benzenskog prstena ili heterocikla u molekuli aminokiseline.
Iz proteinskih aminokarboksilnih kiselina izolirane su dvije aromatske kiseline u kojima se nalazi fenilna skupina (u fenilalaninu) i hidroksifenilni radikal (u tirozinu).
Reakcija ksantoproteina koristi se za određivanje heterocikličke aminokiseline triptofan, koja ima aromatičnu indolnu jezgru. Prisutnost gornjih spojeva u proteinu daje karakterističnu promjenu boje testnog medija.
Koji se reagensi koriste
Za provedbu ksantoproteinske reakcije, morat ćete pripremiti 1% otopinu proteina iz jaja ili povrća.
Obično koristite kokošje jaje, koje se razbije kako biste dodatno odvojili protein od žumanjka. Da bi se dobila otopina, 1% proteina se razrijedi u desetostrukoj količini pročišćene vode. Nakon otapanja proteina, dobivena tekućina mora se filtrirati kroz nekoliko slojeva gaze. Ovu otopinu treba čuvati na hladnom mjestu.
Reakciju možete izvesti s biljnim proteinima. Za pripremu otopine koristi se pšenično brašno u količini od 0,04 kg. Dodati 0,16 l pročišćene vode. Sastojci se miješaju u tikvici, koja se stavlja 24 sata na hladno mjesto s temperaturom od oko + 1 °C. Nakon jednog dana otopina se protrese, nakon čega se prvo filtrira vatom, a zatim papirnatim naboranim filterom. Dobivena tekućina čuva se na hladnom mjestu. U takvoj otopini uglavnom se nalazi frakcija albumina.
Za provedbu ksantoproteinske reakcije, kao glavni reagens koristi se koncentrirana dušična kiselina. Dodatni reagensi su otopina 10% natrijevog hidroksida ili amonijaka, otopina želatine i nekoncentrirani fenol.
Metodologija
U čistu epruvetu dodajte 1% otopinu proteina jaja ili brašna u količini od 2 ml. Dodaje mu se oko 9 kapi koncentrirane dušične kiseline da pahuljice ne ispadaju. Dobivena smjesa se zagrijava, kao rezultat toga, talog postaje žut i postupno nestaje, a njegova boja prelazi u otopinu.
Kada se tekućina ohladi, u epruvetu se uz stijenku doda oko 9 kapi koncentriranog natrijevog hidroksida, što je višak za proces. Reakcija medija postaje alkalna. Sadržaj u tubi postaje narančast.
Značajke
Budući da se ksantoprotein naziva kvalitativnom reakcijom na proteine poddjelovanjem dušične kiseline, tada se ispitivanje provodi ispod priložene dimne nape. Pridržavajte se svih sigurnosnih mjera pri radu s koncentriranim kaustičnim tvarima.
Tijekom procesa zagrijavanja, sadržaj cijevi može biti izbačen, što treba uzeti u obzir prilikom učvršćivanja u držač i odabira nagiba.
Uzimanje koncentrirane dušične kiseline i natrijevog hidroksida smije se vršiti samo staklenom pipetom i gumenom žaruljom, zabranjeno je kucati na usta.
Uporedna reakcija s fenolom
Da bi se ilustrirao proces i potvrdila prisutnost fenilne skupine, sličan se test provodi s hidroksibenzenom.
U epruvetu unesite 2 ml razrijeđenog fenola, a zatim postupno, uz stijenku, dodajte 2 ml koncentrirane dušične kiseline. Otopina se podvrgava zagrijavanju, zbog čega postaje žuta. Ova reakcija je kvalitativna za prisutnost benzenskog prstena.
Proces nitriranja hidroksibenzena dušičnom kiselinom je popraćen stvaranjem smjese paranitrofenola i ortonitrofenola u postotnom omjeru 15 do 35.
usporedba želatine
Da bi se dokazalo da reakcija ksantoproteina na protein otkriva samo aminokiseline s aromatskom strukturom, koriste se proteini koji nemaju fenolnu skupinu.
U čistu epruvetu unesite 1% otopinu želatine u količini od 2 ml. Dodaje mu se oko 9 kapi koncentrirane dušične kiseline. Dobivena smjesa se zagrijava. Otopina ne žuti, što dokazuje odsutnostaminokiseline aromatske strukture. Ponekad se uočava blago žutilo medija zbog prisutnosti proteinskih nečistoća.
Kemijske jednadžbe
Reakcija ksantoproteina na proteine odvija se u dvije faze. Formula prve faze opisuje proces nitriranja molekule aminokiseline pomoću koncentrirane dušične kiseline.
Primjer je dodavanje nitro skupine tirozinu da nastane nitrotirozin i dinitrotirozin. U prvom slučaju, jedan NO2-radikal je vezan na benzenski prsten, au drugom slučaju dva atoma vodika su zamijenjena s NO2. Kemijska formula reakcije ksantoproteina predstavljena je interakcijom tirozina s dušičnom kiselinom kako bi se formirala molekula nitrotirozina.
Proces nitriranja je popraćen prijelazom bezbojne boje u žuti ton. Prilikom provođenja slične reakcije s proteinima koji sadrže aminokiselinske ostatke triptofana ili fenilalanina, mijenja se i boja otopine.
U drugoj fazi, produkti nitriranja molekule tirozina, posebno nitrotirozina, stupaju u interakciju s amonijevim ili natrijevim hidroksidom. Rezultat je natrijeva ili amonijeva sol, koja je žuto-narančaste boje. Ova reakcija je povezana sa sposobnošću molekule nitrotirozina da prijeđe u kvinoidni oblik. Kasnije se iz nje formira sol nitronske kiseline koja ima kinonski sustav dvostruko konjugiranih veza.
Ovako završava reakcija ksantoproteina na proteine. Jednadžba dvafaza je prikazana iznad.
Rezultati
Tijekom analize tekućina sadržanih u tri epruvete, kao referentna otopina služi razrijeđeni fenol. Tvari s benzenskim prstenom daju kvalitativnu reakciju s dušičnom kiselinom. Kao rezultat toga, boja otopine se mijenja.
Kao što znate, želatina uključuje kolagen u hidroliziranom obliku. Ovaj protein ne sadrži aromatične aminokarboksilne kiseline. Kod interakcije s kiselinom nema promjene u boji medija.
U trećoj epruveti uočena je pozitivna reakcija ksantoproteina na proteine. Zaključak se može izvesti na sljedeći način: svi proteini s aromatičnom strukturom, bilo da se radi o fenilnoj skupini ili indolnom prstenu, daju promjenu boje otopini. To je zbog stvaranja žutih nitro spojeva.
Provođenje reakcije u boji dokazuje prisutnost raznih kemijskih struktura u aminokiselinama i proteinima. Primjer želatine pokazuje da sadrži aminokarboksilne kiseline koje nemaju fenilnu skupinu ili cikličku strukturu.
Reakcija ksantoproteina može objasniti žutilo kože kada se na nju nanese jaka dušična kiselina. Mliječna pjena će dobiti istu boju kada se s njom izvrši takva analiza.
U medicinskoj laboratorijskoj praksi ovaj se uzorak boje ne koristi za otkrivanje proteina u urinu. To je zbog žute boje samog urina.
Ksantoproteinska reakcija se sve više koristi za kvantificiranje aminokiselina kao što su triptofan i tirozin u raznim proteinima.
