Protočna citometrija je citološka metoda istraživanja koja se koristi za dubinsku analizu stanica. Njegova prednost je što vam omogućuje proučavanje svake stanice pojedinačno. Ova vrsta analize pomaže procijeniti nekoliko parametara u stotinama stanica u nekoliko sekundi. Kao rezultat toga, citofluorimetrija se smatra jednom od najbržih i najpreciznijih metoda analize koje su trenutno dostupne znanstvenicima i kliničarima.
Princip
Princip protočne citometrije temelji se na mjerenju raspršenja svjetlosti i luminescencije (fluorescencije) stanica. Stanična suspenzija se kao mlaz velikom brzinom propušta kroz stanicu citometra, gdje se ozrači laserom. Tu se izvodi i takozvano hidrodinamičko fokusiranje. Njegov mehanizam je da protok iz ćelije s proučavanim česticama na izlazu teče u vanjski mlaz koji ima veću brzinu. Kao rezultat toga, čestice su poredane u uređenom lancu.
Pre-stanice su označene posebnim fluorescentnim bojama (fluorokromima). Zahvaljujući njima, laserska zrakapobuđuje sekundarni sjaj. Primljene svjetlosne signale registriraju detektori. Nakon toga, informacije se obrađuju pomoću softverskih algoritama koji vam omogućuju prebrojavanje pojedinačnih staničnih populacija koje se razlikuju po nekim kriterijima.
Istraživanje s konvencionalnom mikroskopijom često ne uspijeva razlikovati različite stanice jer izgledaju isto. Citofluorimetrija može pružiti druge podatke (cjelovitost strukture DNK), analizirati ekspresiju proteina, preživljavanje stanica.
Budući da su za pobuđivanje fluorokroma potrebni svjetlosni snopovi različitih valnih duljina, kao i različite vrste detektora, moderne instalacije opremljene su s nekoliko kanala za detekciju (od 4 do 30). Broj laserskih odašiljača može biti od 1 do 7. Složeniji uređaji omogućuju proučavanje više parametara nekoliko svojstava čestica odjednom.
Prednosti i nedostaci
Prednosti protočne citometrije uključuju:
- visoka brzina obrade (registracija do 30 tisuća događaja u 1 sekundi);
- mogućnost proučavanja velikog broja stanica (do 100 milijuna u uzorku);
- Kvantitativno određivanje intenziteta fluorescentnog svjetla;
- analiza svake ćelije;
- simultano proučavanje heterogenih procesa;
- automatsko odvajanje podataka prema populaciji stanica;
- kvalitetna vizualizacija rezultata.
Još jedna značajka ove tehnologije je toanalizirana čestica može se obojati s nekoliko fluorescentnih otopina. Zahvaljujući tome dolazi do višeparametarske studije.
Nedostaci uključuju složenost tehničke opreme i potrebu za posebnom pripremom uzorka.
Citometri
Prvi uređaji ove vrste pojavili su se već 1968. godine u Njemačkoj, ali su postali rašireni mnogo kasnije. Trenutno se svi uređaji koji rade metodom protočne citometrije mogu podijeliti u 2 tipa:
- uređaji koji mjere fluorescentno zračenje (dvije ili više valnih duljina), 10° i 90° raspršivanje svjetlosti (detektor niskog kuta i bočnog raspršenja);
- uređaji koji se, osim mjerenja nekoliko staničnih parametara, automatski razvrstavaju u grupe prema ovim kriterijima.
Detektor raspršenja prema naprijed dizajniran je za određivanje veličine stanice, a uređaj za bočno raspršivanje omogućuje vam da dobijete informacije o prisutnosti intracelularnih granula, omjeru volumena citoplazme i jezgre.
Klasični citometri, za razliku od svjetlosnih mikroskopa, ne dopuštaju dobivanje slike stanice. Međutim, posljednjih godina razvijeni su kombinirani uređaji koji su u stanju kombinirati mogućnosti mikroskopa i citofluorimetra. O njima će se raspravljati u nastavku.
Slikovni citometri
Za instrumente koji se koriste u klasičnoj protočnoj citometriji,jedna je značajka karakteristična: ako se u populaciji analiziranih stanica registriraju rijetki događaji, onda se ne može procijeniti koja je njihova bit. Te čestice mogu biti ili ostaci mrtvih stanica ili rijetka skupina njih. U konvencionalnim uređajima takvi su podaci isključeni iz općeg toka događaja, ali upravo oni mogu biti od posebne vrijednosti za znanstvenu i kliničku analizu.
Nova generacija slikovnih protočnih citometara omogućuje vam snimanje slike svake stanice koja prolazi kroz zonu detektora. Lako ga je vidjeti klikom na odgovarajuće područje dijagrama koje se prikazuje na monitoru računala.
Područja primjene
Protočna citometrija je univerzalna metoda koja se koristi u mnogim područjima medicine i znanosti:
- imunologija;
- onkologija;
- transplantologija (transplantacija crvene koštane srži, matične stanice);
- hematologija;
- toksikologija;
- biokemija (mjerenje kiselosti unutar stanice, proučavanje drugih parametara);
- farmakologija (stvaranje novih lijekova);
- mikrobiologija;
- parazitologija i virologija;
- oceanologija (proučavanje fitoplanktona za procjenu stanja vodenih tijela i drugi zadaci);
- nanotehnologija i analiza mikročestica.
Imunologija
Ljudski imunološki sustav sastoji se od velikog broja stanica. Protočna citometrija u imunologiji omogućuje procjenu njihove strukture i funkcija, odnosno provođenje morfofunkcionalnihanaliza.
Takva istraživanja pomažu razumjeti složenu prirodu imuniteta. Fenotipovi stanica mijenjaju se kao rezultat aktivacije antigenima, razvoja patologija i drugih čimbenika. Citofluorometrija može odvojiti subpopulacije imunoloških stanica u složenu smjesu i procijeniti sve njihove promjene tijekom vremena.
Onkologija
Jedan od najvažnijih zadataka u onkologiji je diferencijacija stanica prema njihovoj vrsti. Princip analize protočnom citometrijom u onkohematologiji temelji se na sljedećem fenomenu: kada se uzorak tretira posebnom fluorescentnom bojom, veže se na citoplazmatske proteine. Nakon diobe u stanicama koje se aktivno razmnožavaju, njegov se sadržaj smanjuje za polovicu. Sukladno tome, intenzitet stanične luminescencije smanjuje se dvostruko.
Postoje drugi načini za otkrivanje proliferirajućih stanica:
- upotreba boja koje vežu DNK (propidij jodid);
- upotreba označenog uracila;
- registracija povećane razine ekspresije ciklinskih proteina, koji sudjeluju u regulaciji staničnog ciklusa.
