PCR, ili polimerazna lančana reakcija, sofisticirana je laboratorijska tehnika koja se široko koristi u medicini i drugim znanstvenim područjima. PCR dijagnostika je svojedobno postala pravi proboj u znanosti.
Opis
Kvantitativni PCR je vrsta PCR-a u stvarnom vremenu.
Ovo se shvaća kao varijanta PCR-a, u kojoj se kinetika reakcije stalno bilježi, što omogućuje kvalitativnu procjenu sadržaja specifičnih DNA nukleotidnih sekvenci u složenoj molekularnoj smjesi.
Kvantitativna PCR metoda bit će razmotrena detaljnije u nastavku.
Suština analize
Kulturološke i serološke metode posebno se često koriste za dijagnosticiranje infekcija. Pod prvim se određuju antitijela na infektivni patogen u krvnom serumu. U drugom, biološki materijal uzet od bolesne osobe koristi se za sjetvu specifičnog medija koji je povoljan za rast kolonija patogena. Dijagnostika u obaslučaj može trajati danima ili tjednima.
PCR pregled može se provesti s različitim biološkim materijalima koji se dobivaju od bolesne osobe. Krv i drugi patološki, fiziološki i biološki mediji i tekućine djeluju kao uzorci. Možete napraviti PCR izmet ili urin.
Atipične i virusne infekcije najčešće se dijagnosticiraju kvantitativnim PCR-om, budući da ih možda nije lako dijagnosticirati zbog specifične prirode patološkog procesa koji je njima izazvan. Za utvrđivanje takvih infekcija potrebno je vrijeme, tijekom kojeg se u tijelu počinju proizvoditi antitijela, određena serološkim metodama. Ali to je u nekim slučajevima neprihvatljivo.
Način izvođenja
PCR metoda - laboratorijsko otkrivanje infekcije u uzorcima izoliranim od pacijenta (in vitro).
Za provođenje lančane reakcije polimerazom potreban je set posebnih reagensa.
Ispitni materijal se unosi u epruvete s reagensima. Epruvete se stavljaju u poseban aparat - PCR pojačivač, koji je dizajniran za amplifikaciju (povećanje broja) željenih fragmenata RNA ili DNA, PCR pojačivač radi u cikličkom načinu rada. U bilo kojem ciklusu, ako uzorci sadrže RNA ili DNA sekvencu patogena, tada se sve više kopija čestica tih nukleinskih kiselina nakuplja u otopini. Možete odrediti prisutnost patogena i njegovu količinu u uzorcima.
Vrste PCR-a
Kvalitativna analiza PCR-om omogućuje vam da dobijete sljedeći rezultat:
- negativan kada patogen od interesa nije pronađen u uzorcima;
- pozitivno ako se u uzorcima pronađu sekvence koje su karakteristične za određeni patogen.
Uz pozitivan PCR rezultat, možemo govoriti s 95% točnošću o prisutnosti dijagnosticirane infekcije. Istodobno, točnost PCR setova koji se koriste u dijagnostičke svrhe doseže 100%.
Obično 5% netočnih rezultata određuje ljudski faktor. Na primjer, kršenje tehnike analize i skladištenja reagensa može značajno smanjiti točnost studije.
Kvantitativni PCR definira koncept virusnog opterećenja. Moguće je odrediti koliko je skupova DNK patogena bilo u uzorcima uzetim od pacijenta.
Ozbiljnost infekcije izravno je proporcionalna povećanju njihovog broja. Također možete odrediti uspješnost terapije za smanjenje virusnog opterećenja.
Prijava za PCR biomaterijal
Kvantitativna PCR se provodi u klinici, uglavnom ujutro. Tijekom posjeta liječniku, pacijentu će se reći što treba poduzeti: struganje, bris, urin ili krv. PCR može otkriti patogene bez obzira na razinu kontaminacije materijala.
Za pozitivnu analizu, u teoriji, potrebna je prisutnost samo jednog patogena u uzorcima. U praksi nastoje stvoriti još povoljnije uvjete. Za to postoje neke preporuke:
- ako uzmu struganje ili bris sa genitalijaorgana, trebate se suzdržati od intimnih odnosa tri dana prije studije;
- ne možete se tuširati antibakterijskim lijekovima ili se oprati prije analize;
- tri sata prije uzimanja brisa iz uretre, morate biti strpljivi i ne prazniti crijeva.
Nemojte slijediti ova pravila prilikom davanja krvi.
Kako se tumače rezultati kvantitativne PCR analize?
Kvantitativna procjena dobivenih rezultata
U nizu kliničkih situacija javlja se problem učinkovitosti liječenja i/ili dinamike patološkog procesa. Takva su pitanja osobito relevantna kod pregleda osoba s kroničnim infekcijama (virus humane imunodeficijencije, hepatitis B i C). Prilikom postavljanja dijagnoze temelje se na činjenici da je nakupljanje amplikona (PCR proizvoda) proporcionalno prisutnosti kopija željenog gena u analiziranom uzorku.
Naravno, uzimajući u obzir rezultate kvantitativne PCR radi se gel elektroforezom uz proučavanje intenziteta posebnih PCR signala. Također, preduvjet za ispravnu kvantitativnu ocjenu dobivenih rezultata su pozitivni pouzdani kontrolni uzorci koji sadrže poznati broj kopija željenog gena (npr. tisuću kopija gena za hepatitis C za jednu PCR reakciju). Nekoliko serijskih razrjeđenja kvantitativne kontrole omogućuju generiranje kalibracijskih krivulja i koriste se za procjenu sadržaja kliničkih genokopija u kliničkim uzorcima.
U definiciji kvantitativnog PCR-a, ključno postignuće je stvaranjefluorescentne DNA sonde koje se dodaju u reakcijsku smjesu istovremeno s jednostavnim primerima i omogućuju praćenje procesa PCR-a na vrijeme, odnosno PCR u stvarnom vremenu.
TaqMan metodologija se odnosi na sintezu fluorescentnih DNA sondi koje su specifične za srednji dio amplikona i imaju dvije oznake na krajevima. Jedna od njih je fluorescentna oznaka, druga je molekula gasitelja za ovu fluorescenciju.
Poseban uređaj, koji je hibrid fluorimetra i termoblok-pojačala, vrši stalna mjerenja fluorescencije u svakoj epruveti (PCR princip u stvarnom vremenu). Nakon 20-40 ciklusa PCR-a, za svaki uzorak će se dobiti pojedinačne krivulje. Broj kopija željenog gena koji se nalazi u testnom uzorku može se izračunati iz kalibracijskih krivulja s kontrolnim uzorcima.
Također, važna značajka provedbe PCR-a fluorescentnom metodom je da nema potrebe otvarati epruvete s PCR smjesom kada se uzimaju u obzir rezultati. Time se smanjuje mogućnost kontaminacije prostorije proizvodima za pojačavanje i nema potrebe za dodjeljivanjem posebnih radnih područja za elektroforezu.
Što pokazuje kvantitativni PCR transkript?
Što se otkriva?
Postupkom kao što je kvantitativni PCR, pronalaze se kvalitativne promjene u genima: insercije, delecije i točkaste mutacije. Ali kod nekih nasljednih poremećaja, odgovarajući se simptomi pojavljuju kao odgovor na promjenu sadržaja određenih gena.
HvalaKvantitativna analiza daje numerički rezultat, najčešće u IU / ml. To znači da je u jednom mililitru testnog uzorka pronađen određeni broj kopija RNA ili DNK patogena, mjereno u međunarodnim jedinicama.
Ovisno o veličini, dijagnosticira se ozbiljnost infekcije. Krv se obično testira kako bi se odredilo virusno opterećenje, jer se virusi slobodno kreću u krvi tijekom bolesti.
Značajke
Kvantitativni PCR u testu krvi ima dvije značajke.
- Analiza se provodi u prisutnosti početnica ili deoksiribonukleozid trifosfata, koji su označeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom kako bi se točno odredio sadržaj formiranog PCR proizvoda.
- U PCR procesu, završite reakciju ranije prije nego što se pojavi previše PCR proizvoda. To je zbog činjenice da u završnoj fazi zasićenja, kada ima puno PCR proizvoda, i sam enzim i supstrati djeluju kao ograničavajuće veze ove reakcije. Završetak sljedećeg PCR ciklusa u takvim uvjetima više nije karakteriziran udvostručenjem broja PCR proizvoda, izravnavaju se beznačajne kvantitativne razlike između različitih uzoraka, koje su prilično jasno definirane u ranim fazama nakon prolaska kroz niz reakcijskih ciklusa..
Cijena PCR dijagnostike
PCR istraživanje ima cijenu, koja ovisi o vrsti infekcije koja će se testirati, o metodologiji analize i testnom materijalu. Da biste utvrdili jednu infekciju, morat ćete popustiti200-800 rubalja. Dodata je i naknada za uzimanje biomaterijala - otprilike 400 rubalja.
