Kromatografija je jedna od metoda za odvajanje tvari. Koristi se za naknadnu kvalitativnu i kvantitativnu analizu fizikalnih i kemijskih svojstava mikročestica. Varijanta ove tehnologije je afinitetna kromatografija. Ideja o diferenciranju proteinskih spojeva korištenjem svojstva molekularnog afiniteta poznata je u znanosti već nekoliko desetljeća. Međutim, razvio se tek posljednjih godina, nakon uvođenja visokoporoznih hidrofilnih materijala koji se koriste kao matrica. Ova metoda omogućuje rješavanje i analitičkih problema (odvajanje tvari i njihova identifikacija) i preparativnih problema (pročišćavanje, koncentracija).
Essence
Afinitetna kromatografija (od latinske riječi affinis - "susjedan", "povezan") temelji se na afinitetnim interakcijama, koje su stvaranje visoko specifičnih veza između molekule razmaknice (liganda ili afinata) i ciljne molekule. Ovi mehanizmi su rašireni u prirodi (povezivanje medijatora ili hormona i receptora, antitijela iantigeni, hibridizacija polinukleotida i druge vrste procesa). U medicini se afinitetna kromatografija koristi u praktične svrhe od 1951.
Komponente su odvojene na sljedeći način:
- radna otopina koja sadrži tvar koju treba izolirati propušta se kroz sorbent;
- ligand položen na matricu sorbenta zadržava ovu tvar;
- koncentrirano je (akumulacija);
- ekstrakcija izolirane tvari iz sorbenta ispiranjem s otapalom.
Ova metoda vam omogućuje da izolirate cijele stanice. Razlika od tradicionalne sorpcijske kromatografije je u tome što postoji snažno biospecifično vezanje izolirane komponente na sorbent, koju karakterizira visoka selektivnost.
Adsorbenti
Sljedeće tvari se koriste kao adsorbenti:
- Gel spojevi na bazi agaroze, polisaharida dobivenog iz agara. Najčešće se koriste 3 varijante: sefaroza 4B, CL (poprečno povezana agaroza) i affi-gel. Potonji sastav je modificirani gel agaroze i poliakrilamida. Ima veću biološku inertnost, visoku kemijsku i toplinsku otpornost.
- Silika (silika gel).
- Staklo.
- Organski polimeri.
Kako bi se uklonile mehaničke prepreke tijekom kontakta liganda, koriste se dodatne tvari za odvajanje od nosača (peptidi, diamini, poliamini, oligosaharidi).
Oprema
Oprema za afinitetnu kromatografiju uključuje sljedeće glavne jedinice:
- spremnici za mobilnu fazu (eluent);
- visokotlačne pumpe za srednju opskrbu (najčešće klipne);
- filter za čišćenje eluensa od prašine;
- uređaj za doziranje;
- kromatografski stupac za odvajanje smjese;
- detektor za otkrivanje odvojenih komponenti koje napuštaju stupac;
- kromatogramski snimači i mikroprocesorska jedinica (računalo).
Kako bi se smanjila količina otopljenog zraka, helij se prvo propušta kroz mobilnu fazu. Za promjenu koncentracije eluensa instalirano je nekoliko crpki kojima upravlja programator. Kromatografske kolone izrađene su od nehrđajućeg čelika (za povećane zahtjeve za otpornošću na koroziju), stakla (univerzalna opcija) ili akrila. Za preparativne svrhe njihov promjer može varirati od 2 do 70 cm. U analitičkoj kromatografiji koriste se mikrokolone Ø10-150 µm.
Da bi se povećala osjetljivost detektora, u smjesu se uvode reagensi koji doprinose stvaranju tvari koje apsorbiraju više zraka u ultraljubičastom ili vidljivom području spektra.
Metodologija
Postoje 2 glavne vrste tekućinske afinitetne kromatografije:
- Kolona, u kojoj se kolona puni stacionarnom fazom i kroz nju se propušta smjesa uz protokeluent. Odvajanje se može dogoditi pod pritiskom ili pod gravitacijom.
- Tan sloj. Eluent se kreće duž ravnog sloja adsorbenta pod utjecajem kapilarnih sila. Adsorbens se nanosi na staklenu ploču, keramičku ili kvarcnu šipku, metalnu foliju.
Glavne faze rada uključuju:
- priprema adsorbenta, fiksacija liganda na nosač;
- dovođenje smjese za odvajanje u kromatografsku kolonu;
- učitavanje u mobilnoj fazi, vezanje komponenti pomoću liganda;
- zamjena faze za izolaciju vezane tvari.
Odredište
Afinitetna kromatografija koristi se za izolaciju sljedećih vrsta tvari (vrsta korištenog liganda navedena je u zagradama):
- analozi enzimskih inhibitora, supstrata i kofaktora (enzima);
- bioorganske tvari sa znakovima genetske stranosti, virusi i stanice (antitijela);
- ugljikohidrati visoke molekularne težine, monosaharidni polimeri, glikoproteini (lektini);
- nuklearni proteini, nukleotidiltransferaze (nukleinske kiseline);
- receptori, transportni proteini (vitamini, hormoni);
- proteini u interakciji sa staničnim membranama (stanicama).
Ova tehnologija se također koristi za dobivanje imobiliziranih enzima, a njihovo vezanje na celulozu omogućuje proizvodnju imunosorbenata.
Kromatografija proteina koji vežu DNA
Izolacija DNA-vezujućih proteina provodi se pomoćuheparin. Ovaj glikozaminoglikan je sposoban vezati širok raspon molekula. Afinitetna kromatografija proteina ove skupine koristi se za izolaciju tvari kao što su:
- faktori inicijacije i produljenja translacije (sinteza molekula nukleinske kiseline i proteina);
- restriktaze (enzimi koji prepoznaju određene sekvence u dvolančanoj DNK);
- DNA ligaze i polimeraze (enzimi koji kataliziraju spajanje dviju molekula za stvaranje nove kemijske veze i uključeni su u replikaciju DNK);
- inhibitori serinske proteaze koji igraju važnu ulogu u imunološkim i upalnim procesima;
- faktori rasta: fibroblast, Schwann, endotel;
- proteini ekstracelularnog matriksa;
- hormonski receptori;
- lipoproteini.
Dostojanstvo
Ova metoda je jedna od najspecifičnijih za izolaciju reaktivnih spojeva (enzima i većih agregata - virusa). Međutim, ne koristi se samo za izolaciju biološki aktivnih tvari.
Detekcija antitijela u malim količinama, kvantitativna procjena poliadenilne kiseline, brzo određivanje molekularne mase dehidrogenaza, uklanjanje određenih zagađivača, proučavanje kinetike aktivacije neaktivnog oblika tripsina, molekularna struktura čovjeka interferoni – ovo nije cijeli popis studija u kojima se koristi afinitet.kromatografija. Upotreba u klinici je zbog njenih prednosti kao što su:
- Učinkovita sposobnost čišćenjaproteini, polisaharidi, nukleinske kiseline. Oni se neznatno razlikuju po svojim fizičkim i kemijskim svojstvima i gube aktivnost tijekom hidrolize, denaturacije i drugih vrsta tretmana koji se koriste u drugim metodama.
- Brzina odvajanja tvari, dinamička priroda procesa.
- Nema potrebe za posebnim pročišćavanjem enzima i homogenizacijom izoenzima za određivanje konstanti disocijacije.
- Mogu odvojiti širok raspon tvari.
- Mala potrošnja liganada.
- Mogućnost odvajanja tvari u velikim količinama.
- Reverzibilni proces vezivanja bioloških makromolekula.
Ova tehnika se može kombinirati s drugim, kako bi se nametnulo dodatno polje (gravitacijsko, elektromagnetno). To vam omogućuje da proširite tehničke mogućnosti kromatografije.
Enzimatski inženjering
Zahvaljujući ovoj metodi započeo je aktivan razvoj nove grane biotehnologije - enzimskog inženjerstva.
Afinitetna kromatografija za izolaciju enzima ima sljedeće prednosti:
- dobivanje enzima u velikim količinama kao rezultat kraćeg vremena, kao rezultat - njihovo smanjenje cijene;
- imobilizacija enzima može značajno proširiti opseg njihove primjene u medicini i industriji;
- Povezivanje enzima s netopivom čvrstom podlogom omogućuje proučavanje utjecaja mikrookoliša i smjera reakcija, koji igraju važnu ulogu u prirodnim i fiziološkim procesima.
