Rekombinantna DNK su molekule formirane laboratorijskim tehnikama genetske rekombinacije za kombiniranje genetskog materijala iz više izvora. To je moguće jer molekule DNK svih organizama imaju istu kemijsku strukturu i razlikuju se samo po nukleotidnom slijedu unutar nje.
Stvaranje
Molekularno kloniranje je laboratorijski proces koji se koristi za stvaranje rekombinantne DNK. To je jedna od dvije najčešće korištene metode, zajedno s lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Omogućuje vam kontrolu replikacije bilo koje određene sekvence DNK koju odabere eksperimentator.
Postoje dvije temeljne razlike između metoda rekombinantne DNK. Jedan je da molekularno kloniranje uključuje replikaciju u živoj stanici, dok PCR uključuje in vitro. Druga razlika je u tome što prva metoda omogućuje rezanje i lijepljenje sekvenci DNK, dok je druga poboljšana kopiranjem postojećeg reda.
Vektorski DNK
Dobivanje rekombinantne DNK zahtijeva vektor za kloniranje. Potječe iz plazmida ili virusa i relativno je mali segment. Izbor vektora za molekularno kloniranje ovisi o izboru organizma domaćina, veličini DNA koja se klonira i hoće li se strane molekule ekspresirati. Segmenti se mogu kombinirati različitim metodama kao što je kloniranje restrikcijskim enzimom/ligazom ili Gibsonov sklop.
Kloniranje
U standardnim protokolima, kloniranje uključuje sedam koraka.
- Odaberi organizam domaćina i vektor za kloniranje.
- Dobivanje DNK vektora.
- Formiranje klonirane DNK.
- Stvaranje rekombinantne DNK.
- Uvođenje u organizam domaćina.
- Odabir organizama koji ga sadrže.
- Odabir klonova sa željenim DNK umetcima i biološkim svojstvima.
Nakon transplantacije u organizam domaćina, strane molekule sadržane u rekombinantnom konstruktu mogu, ali ne moraju biti eksprimirane. Ekspresija zahtijeva restrukturiranje gena kako bi se uključile sekvence koje su neophodne za proizvodnju DNK. Koristi ga hostov prevoditeljski stroj.
Kako radi
Rekombinantna DNK djeluje kada stanica domaćina eksprimira protein iz rekombinantnih gena. Ekspresija ovisi o okruženju gena skupom signala koji daju upute za njegovu transkripciju. Oni uključuju promotor, vezivanje ribosoma i terminator.
Problemi nastaju ako gensadrži introne ili signale koji djeluju kao terminatori za bakterijskog domaćina. To dovodi do prijevremenog prekida. Rekombinantni protein može biti nepropisno obrađen, presavijen ili razgrađen. Njegova proizvodnja u eukariotskim sustavima obično se događa u kvascima i filamentoznim gljivama. Korištenje kaveza za životinje je teško zbog potrebe za snažnom potpornom površinom za mnoge.
Svojstva organizama
Organizmi koji sadrže rekombinantne DNA molekule imaju naizgled normalne fenotipove. Njihov izgled, ponašanje i metabolizam obično se ne mijenjaju. Jedini način da se pokaže prisutnost rekombinantnih sekvenci je ispitivanje same DNK pomoću testa lančane reakcije polimeraze.
U nekim slučajevima, rekombinantna DNK može imati štetne učinke. To se može dogoditi kada se njegov fragment koji sadrži aktivni promotor nalazi pored prethodno tihog gena stanice domaćina.
Koristite
Tehnologija rekombinantne DNK naširoko se koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanju. Njegovi proteini i drugi proizvodi mogu se naći u gotovo svakoj zapadnoj ljekarni, veterinarskoj klinici, liječničkoj ordinaciji, medicinskom ili biološkom laboratoriju.
Najčešća primjena je u temeljnim istraživanjima, gdje je tehnologija ključna za veći dio današnjeg rada u biološkim i biomedicinskim znanostima. Rekombinantna DNA se koristi za identifikaciju, mapiranje i sekvenciranje gena te njihovo određivanjefunkcije. rDNA sonde se koriste za analizu ekspresije gena u pojedinačnim stanicama i u tkivima cijelih organizama. Rekombinantni proteini se koriste kao reagensi u laboratorijskim pokusima. Neki konkretni primjeri navedeni su u nastavku.
Rekombinantni kimozin
Pronađen u sibuhu, kimozin je enzim potreban za proizvodnju sira. Bio je to prvi genetski modificirani aditiv hrani korišten u industriji. Mikrobiološki proizveden rekombinantni enzim strukturno identičan enzimu dobivenom od teleta jeftiniji je i proizvodi se u većim količinama.
Rekombinantni ljudski inzulin
Virtualno zamijenjen inzulin dobiven iz životinjskih izvora (npr. svinje i goveda) za liječenje dijabetesa ovisnog o inzulinu. Rekombinantni inzulin se sintetizira uvođenjem gena za humani inzulin u bakterije iz roda Eterichia ili kvasac.
Hormon rasta
Propisuje se pacijentima čija hipofiza ne proizvodi dovoljno hormona rasta za normalan razvoj. Prije nego što je rekombinantni hormon rasta postao dostupan, dobivao se iz hipofize leševa. Ova nesigurna praksa navela je neke pacijente da razviju Creutzfeldt-Jakobovu bolest.
Rekombinantni faktor koagulacije
Ovo je protein za zgrušavanje krvi koji se daje pacijentima s oblicima hemofilije s poremećajima krvarenja. Oni nisu u stanju proizvoditifaktor VIII u dovoljnim količinama. Prije razvoja rekombinantnog faktora VIII, protein je napravljen obradom velikih količina ljudske krvi od više darivatelja. To je nosilo vrlo visok rizik od prenošenja zaraznih bolesti.
Dijagnoza HIV infekcije
Svaka od tri široko korištene metode za dijagnosticiranje HIV infekcije razvijena je korištenjem rekombinantne DNA. Test na antitijela koristi njezin protein. Otkriva prisutnost HIV genetskog materijala pomoću lančane reakcije polimeraze reverzne transkripcije. Razvoj testa omogućen je molekularnim kloniranjem i sekvenciranjem HIV genoma.
